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生物组织形成分析软件meerkat

2019年4月13日 - 生物科技

一、 运行meerkat

    前面已经依序安装了meerkat
的环境和meerkat,运维了预处理一步,在相呼应的bam文件目录下生成了多量文件,因而,当要用meerkat处理某些bam文件时,应先将该bam文件移动到专有的三个文件夹,manual中也建议那样用。

     预处理生成的手提袋括:

生物科技,     黑名单文件.gz

     isinfo文件:包涵插入大小音讯

     pdf文件:插入大小的遍布图,unmapped reads长度的遍布图,softclip
reads长度分布图

    
pre.log文件:日志文件,包含输入的参数,输入输出消息,reads数,unallign
reads数等

     softclips.fq.gz: softlip reads文件,完整的read

     softclips.rdist:softclip 的reads长度分布音信记录

     unmapped.fq.gz:unmapped的reads 文件,完整的read

     unmapped.rdist: unmapped的reads长度的遍布消息

     sr1.fq.gz : 从softclip read 可能 unmaped read 切下来的钦定bp
的reads

     sr2.fq.gz :  与sr1.fq配对的reads

     二个文件夹包含一_1fq.gz,1_二fq.gz , 
里面有分裂尺寸的reads。每一个read group 人工的reads 对

   

    

   1.1  meerkat.pl

          perl ./scripts/meerkat.pl [options]

         -b  FIle    已经sort过的bam文件

         -k  int    [0/1]是否利用预处理产生的黑名单文件,默许壹

         -d  FLT    call discordant mate pairs
的正规差阈值,默许3.以此选项控制什么寻找discordant
read对,等同于定义最大的concordant
fragment(配对的reads定位到的壹些),总括方法是:中位插入大小+d x
sd,要是插入大小分布图狭窄并对称,就应用暗中认可参数,例如上边一2图。倘使分布图偏宽,或许带着长尾,三肆图,参数应设为伍,对于高深度(>30x),固然分布图狭窄,可是选取5会轻微好一点。假若峰窄,但是仍然带着1个尾巴(图5),好像超过四六%TCGA数据那样,在meekat.pl这一步使用5比叁越来越好

生物科技 1

 

 

 生物科技 2

 生物科技 3

 

 

         -c  FLT    集簇discordant mate
pair标准差阈值,私下认可和-d相同。控制什么集簇,创设断点的置信区间。等同于定义覆盖断点的最大学一年级些(中位插入大小+c
x sd)。假若-d 选项是5大概小于伍,使用用-c相同的参数,假诺-d
非常的大,比如10,那么使用越来越小的-c,比如伍。假使数量有很高的测序深度,恐怕有广阔的正片的变化,那么使用五而不是三来防止不能够创设断点的置信区间。

         -p  FLT    call2个轩然大波扶助的配对数阈值,暗中同意贰

         -o  INT   
必要补助全长reads对的数据,默许是0,设定那一个选项会下滑小复杂事件的敏感度。假设利用-a
1 -l 1推荐应用-o 一 来幸免双重连串导致的重重人工业生产物

         -q  INT    call一个轩然大波帮助的split reads数,暗许是1

         -z  INT    事件数的最大值,暗中同意一,000,000,000

         -s  INT    从unmapped reads
开头和后边切下来的bp数,必须和与拍卖的-s 参数设置1样

         -m  INT    [0/1],就算设定为一,使用meerkat
去去除duplicates,假设设为0,使用Picard 的 flag ‘d‘ marked
,或许其余工具去除duplicates.bwa mem 的数据必须用picard mark duplicate
,所以要设为0.

          -a  INT   
[0/1],处理非单1比对,私下认可1。倘诺测序品质倒霉,也许测序深度不够,将参数设为0,那样一切成对的reads都被当作纯粹比对使用。那信赖bwa
mapping 时生成的XT标签。倘若未有XT标签,使用接纳Q.

          -u  INT   
[0/1],使用bam文件的成套比对,纵然BAM文件不是由BWA爆发的,可能由bwa爆发然而从未XT标签,那么开这一个选项,开了这么些选项会强制关闭-a选项。暗许是0。开了那一个选项之后应采纳-Q
参数过滤低mapping
reads,推荐-Q设置10,对于bwa比对过的bam,也得以持续过滤。

          -Q  INT    被选取的reads的极小mapping quality,默许是0

          -g  INT    
在根本的bam文件使用的备择mapping数,暗中同意使用壹切。备择mapping
数从前经过bwa -N 参数输出到XA标签中。bwa mem 默许 输出备择mapping。

          -f  INT    在clipped
比对初级中学结业生升学考试虑的备择mapping数,暗中同意使用成套。

          -l  INT    [0/1],是或不是考虑clipped
比对,暗中认可一.和预处理壹样,对于bwa mem 出来的基因组,不须要重新mapping.

          -t  INT    在bwa比对中用到的核数,私下认可1

          -R  STR    包涵黑名单read group的文件,每1行1个read
group ID

          -F  STR    fasta文件夹路径

          -S  STR    samtools路径,固然samtools不在环境变量中的话

          -W  STR    bwa路径,倘使bwa不在环境变量中的话

          -B   STR    blastall 和 formatdb
的不二等秘书诀,倘诺不在环境变量的话

          -P  STR   
钦点运转顺序,dc|cl|mpd|alg|srd|rf|all,暗中同意all,每一步运维都亟待上一步的结果

                            dc:  extract discordant read
pairs,提取discordant read对

                            cl:  construct clusters of discordant read
pairs,将discordant read对建簇

                            mpd: call events based on read
pairs,基于read 对call 事件

                            alg: align split reads to candidate break
point regions,比对split read
到候选的断点区域。如若你有多中央的话,能够将alg步骤切为两步,alg一和alg二,alg1运维二10十二线程,alg二运营单线程。

                            srd:  confirm events based on split reads
and filter results,基于split reads和过滤的结果对事件展开认证

                            rf: refine break points by local
alignments,通过区域比对定义断点

                            all: run all above steps ,运行总体手续

           -h    帮助

    manual 中的举例:

    50bp reads,<10x 的TCGA 基因组    使用-s 1八 -d 五 -a 0 -l 0 -q
一,揣度:reads 长度较小,所以取1/叁 read 长度,-s 取18, TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d 设为伍, 测序深度较低,reads
长度较短,所以尽或许保留数据,-a 设为0, -l 设为0,-q 设的较低,1。

    75-101bp reads, 30-40x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 三 -o 1-a 0 -u 1 -Q 十,测度:reads长度较长,取1/伍read长度,-s 取20,TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d
设为5,长度较长,深度较深,因而下降敏感度,扩充特异度,所以-p 设为3,-o
设为一,由于尚未XT tag和XA tag ,由此-a 1 选项不能运维,由此设为-u ① -a 0
-Q 十 。若是那是bwa mem的数量来说,参数应设为-s 20 -d 五 -p 3 -o 一 -m 0
-l 0,bwa mem 数据不需求再一次比对softclips -l
0,必须用picard去除duplicate,-m设为0,估计那个是早版本的bwa,由此比对时方可生成XT标签,-a
暗许为一。

    101bp reads, 60-80x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 伍 -o
3,75-十一bp 使用-s 20,TCGA基因组使用-d 5,测序深度深,-o 设置越来越高三。

   
如若肿瘤基因组60x,相对应的健康基因组30x,那么使用60x的参数,平日用配对的常规组织中的black.list.gz
重命名并放到肿瘤bam文件处理的文本夹,替换cancer的blacklist.gz文件。

       

     1.2 mechanism.pl

       perl
./scripts/mechanism.pl [options]

        -b  FILE    sort过的bam文件

        -o  INT    [0/1]在TE包括rmsk类型 \”Other\”,默认1

        -t  INT    TE的最大值,暗许一千00

        -z  INT    被拍卖的SV的数额限制,暗许一千000000

        -R  STR    repeat注释路径,能够从UCSC下载

        -h  help

 

二、参照

   
manual中提交的多少,HapMap个体NA1850七(4二x深度,十0bp读长,500bp插入大小),用十核bwa比对费用1.三天和十GB的内部存款和储蓄器。30x深度的瘤子数据,要多于两日并且超越30G的内部存款和储蓄器,假设测序品质不太好,比如很多的嵌合比对和不可胜举非单1mapped的reads,就会开支更多的年华和内部存款和储蓄器。、

 

三、结果

   
运维完预处理和meerkat.pl后,能够获取四个文件.intra.refined.typ.sorted和inter.refined.typ.sorted,运营完mechanism.pl后,会拿走.variants文件,否则,就该回去看一下装置是或不是出现难点。

    
运营的瘤子基因组文件的时候,一定要把例行协会的blacklist文件替换肿瘤基因组的blacklist文件,blacklist文件能够在预处理中生成。即便在预处理中出现错误新闻“differing
read lengths“,未有涉及,仅仅是报告您在局地read group中长度不等同。

 

 4、包罗的其他程序

    4.1
转换variant 文件到vcf格式**
   **

perl ./scripts/meerkat2vcf.pl -i variantfile -o vcffile -H headerfile -F /db/hg18/hg18_fasta/

    -F选项能够发生二个头文件

    肆.二  融合基因注释

 

perl ./scripts/fusions.pl -i variantfile -G /db/hg18/refGene_hg18_sorted.txt

 

    肆.三  为形成位点设计引物

        使用primer.pl

        -i  FILE    输入文件,fusion.pl发生的玉石俱摧文件

        -o  FILE    输出文件

        -p  STCRUISER    引物固定系列

         -c  INT   
列数补偿,私下认可0,要是第三列存在哪些事件的样品名称,那么设为壹

         -f  INT    侧翼区域,暗中认可500,设计引物所在的区域

         -s  ST酷路泽    被“,”分隔的引物大小,暗中认可20,二三,二伍,二七

         -m  ST安德拉    引物最小,最优,最大Tm值,”,”分隔,默许50,60,陆5

         -n  INT    对每三个引物片段,设计的音物个数,暗中同意5

          -r  INT    掩盖repeat,默认0

          -q  INT    输出设计引物的侧翼系列

          -F  ST本田UR-V    fasta文件文件夹路径

          -P  STR    primer_core程序文件夹路径

          -L  STR    bla文件夹t路径

          -V  ST福睿斯    blat服务器,例如fServer start 拾.11.240.76
17777/reference/hg18/hg1八.2bit -stepSize=5,服务器路径应该为10.1一.240.7陆

          -T  STKuga    blat端口,上边例子中的1777七

          -h  help

   
全体音物都以由Primer三生成,对于每三个事件,挑出.1和.二,分裂的大势认为是见仁见智的风浪,所以取引物的时候一贯拷贝出来,不必要格外的反向互补,借使种类是小写字母,那么注脚引物在再度连串。理论上,你应有用
一 blat hit 挑出小写的引物。如若blat hit
是0,意味着由太多hit了,所以并非挑选那种引物。有时候,就算引物是在再度序列上(小写字母),可是在基因组上还是是单纯比对的,(1blat
hit),因为是再度元件的变异,挑选那种引物是能够的。假诺由壹些引物PC奥迪Q三未有结果,你能够选用3个正向引物,三个反向引物来还要拓展陆个PC奥迪Q3 反应。引物设计的大规模规则如故要使用,比如,你应当选取TM
值相差十分小并且GC含量不太极端的。

    四.四  总结等位基因频率

        使用discon.pl,这一个脚本会告诉您壹切断点的discordant 和
concordant的read对.

        -i  FILE    输入variants 文件,必须

       -o  FILE    输入文件,必须

       -D  INT    从bam文件中计算discordant
pair的数量,默许0,基因分型的时候打开那个选项

       -B  FILE    bam文件,必须

       -C  FILE    由Meerkat 产生的cluster文件,必须

       -I  FILE    Meerkat 运维时发生的isinfo文件

       -K  FILE    蕴含要不经意的read group的文书名,二个read ID 一行,和
meerkat.pl的库罗德参数壹样

       -S  FILE    samtools文件夹路径,要是samtools不再环境变量中

       -d  FLT    call discordant read 对的标准差阈值,暗中同意3

       -Q  INT    使用的reads 最小的mapping quality,默认0

       -h  help

      

perl ./scripts/discon.pl -d 5 -Q 10 -i $somaticg -o $somaticg_rp -B $cancer_bam -C
$cancer_cluster -I $cancer_isinfo -K $cancer_blacklistrg -S /home/ly55/opt/samtools/

    结果文件之中每三个轩然大波有三个 EvoqueP tag ,A_B_C_D格式

    A:全长的discordant read 对数

    B:从部分比对的reads中discordant的reads数

    C:第2断点的concordant reads 数

    D:第1断点的concordant reads数

    A+B应该等与Meerkat获得的总的reads数

       

 

 以上内容仅作个人笔记使用,仅供参考

 

参考资料

meerkat manual
:http://gensoft.pasteur.fr/docs/Meerkat/0.189/Manual\_0.189.pdf**
**

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