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微生物测序样本准备方法总结微生物

2019年4月7日 - 微生物

 

微生物 1

在微生物测序中,样本的备选从根本上是承接保险获得高品质DNA的前提,而样本准备也多亏让无数微生物科学商量工小编感到苦恼的主要一步。后天就给大家分类介绍一下广阔的微生物样本类型及采集样品方法

 

微生物测序样本准备方法

 

医口样本类型

样本 种类 推荐生物学重复
肠道 粪便,粘膜 6, 推荐 10
液体 尿,血液,脑髓液,唾液,痰,肺泡灌洗液,羊水 同上
拭子 口腔,生殖道,皮肤 同上
其它 组织,肝脏,眼部,胎盘等 同上

 

农口样本类型

样本 种类 推荐生物学重复
土壤 普通土,根际土,稻田土,污泥,沙土 3(多点取样), 推荐5
水体 水库,河流,污水,海水,中水,油田,尾矿池,牛奶 同上
肠道 动物粪便,肠道 6,推荐>10
其它 根内生菌,瘤胃,发酵液,单菌,病毒 同上

 

医口常见样本采集方法

 

粪便样本采集

一)准备好便盆和大便容器,洗手,带上手套收集新鲜的粪便样本;

贰)在实验室将装好受试者粪便样本,马上放在冰上进行分装并标记;

三)用无菌牙签或大便取样器截取样品中段里部(粪便表层含有肠粘膜脱落细胞),外部简单传染,且接触空气后,部分细菌
DNA 初始降解;

四)用灭菌离心管每管称取0.五-拾g左右粪便样本,每种样本取多管备份;

5)分装好后,若当天领取DNA,能够先放4°C,短期存放需先快捷放入液氮中,之后立时放入-80°C保存。

注:如粪便样品量较多或无法登时收集,最迟要在2时辰以内全部收集完。

 

肠道内容物样品采集

1)在试验对象与世长辞后,用无菌解剖刀,在无菌状态下取出整个肠道,切取所需肠段的内容物(条件允许的话,可在无菌操作台进行);

二)用无菌手术刀挖取内容物,立时放在冰上举行分装并标记;

3)用灭菌离心管分装,单个样本取样量:0.2-0.伍g/管。为力保实验顺遂举办,每一个样本取多管备份,在采集样品允许的状态下,尽量多搜集样品;

肆)分装好后,若当天领取DNA,能够先放4°C,短时间存放需先急迅放入液氮中,之后马上放入-80°C保存。

 

肠道组织样本采集 

一)组织样本用无菌铁铝酸盐缓冲液轻轻清洗,直到未有内容物流出;

二)用无菌的显微镜玻片刮取附着在外部的团体细菌进行DNA的领取;

3)短期存放需先快速放入液氮中,之后立时放入-80°C保存。

 

生殖道样本采集

一)48h内无性行为,不得开始展览私处清洗、上药等转移菌群结构的行为,30天内不能够用抗生素和抗真菌类药物;

2)用无菌棉签丰富取样,用无菌剪刀剪下棉签底部,放入装有Amies作育基的无菌离心管中,置于冰上带至实验室-80℃保存;

3)样本体贴,需进行多管备份保存;

四)提取DNA时将棉签解冻,漩涡处理伍min以重悬细胞。

 

唾液样本采集

壹)收集唾液样品时,用蜡胶刺激口腔分泌唾液,然后用伍mL的无菌离心管收集壹mL;

二)全部的样品收集完后放于-80°C下封存。

 

农口常见样本采集方法

 

平凡土壤样本采集

一)依照研究指标明确采集样品范围,取样器具要先行消毒灭菌处理,初阶采集样品;

2)去除表面浮土,使用乙酸乙酯火烧的铲子挖取地下5~20cm的土层;

三)去除可知杂质后,土壤过二mm筛网,每一个样品从二个及以上采集样品点采访并混合而成,每5~10g分成1份;

四)保存于无菌离心管中,置于0℃以下运回实验室,用于抽提DNA;

伍)如无法立刻提取,置于-80℃保存。

 

根际土壤样本采集

壹) 使用的器物要先行消毒灭菌处理,采集20cm深的根际土壤于50mL的无菌管里;

贰)
用20指标筛子过筛,去除植物根、动物残骸以及此外废品后分装到无菌离心管里,每管三~五g,急迅放在液氮里积存;

三) 密封后立即放于-80℃储存备用。

 

水体样本采集

壹) 依照研究指标鲜明采集样品深度和范围;

2)
采集好的水样需求经过滤膜实行过滤,能够根据水样的污浊程度选拔相应孔径的滤膜;

3) 将滤膜-80℃保存备用。

注:清亮水样:可挑选小孔径的滤膜,1般选0.2二μm或0.四伍μm的滤膜,过滤水样体积大于十L;

污浊水样:过滤前静置分离悬浮颗粒,也能够用大孔径的滤膜预过滤二遍,再用小孔径的滤膜举行过滤。

 

活性污泥及沉积物样本采集

活性污泥:从曝气池中取二五mL上浮的活性污泥样本放入无OdysseyNA酶的管中,赶快放入液氮并运载到实验室提取DNA;

地球表面沉积物:取距地表0-10cm的地球表面沉积物,种种位点取一-二kg的沉积物装入消毒聚乙苯塑料袋中,即刻置于0℃运到实验室进行DNA提取。

 

植物内生菌样品采集

一)用流水冲洗植物根样本表面并摘到小侧根,粘根土壤粒要拓展化学消毒(9伍%的次氯酸钠二min);

二)用无菌玻璃珠在无菌水中剧烈晃动,物理去除细菌;

三)用手术刀片划开根部协会以释放内生菌;

四)用无菌玻璃珠在玖%的氯化钠中振荡,在30℃的尺度下震动4h以分别内生菌;

5)用伍μm滤膜过滤,壹5000rpm,四℃离心收集沉淀并内置液氮中保存。

 

微生物三种性商量十三分规样本取样方法

 

小鼠肺泡灌洗液

肺脏感染是一种常见疾病,病原系列多,耐药性强。支气管肺泡灌洗液(
bronchoalveolar lavage
fluid,BALF)直接取材于病变部位,得到病原菌的空子多,并能大幅缩减口咽部定植微生物群对标本的传染,升高病原菌的分离率。

 

小鼠肺泡灌洗

貌似为颈部和胸部解剖,气管和两旁肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端,生理盐水或PBS反复冲洗,一般为2次,每遍冲洗次数依据供给控制,
三~7遍即可,具体操作参考:

一)操作所需的装备(全数装备均需是无菌的);

二)小鼠麻醉并一定;

三)颈部去毛并消毒;

四)行颈部正中切口;

5)揭示剥离气管,并在气管近端穿线打活结,活结要相比松;

陆)在所打活结的远端,剪开气管的4/8,行气管插管,插入后线打死结;

七)一ml注射器抽取一ml的灭菌生理盐水,通过呼吸系统插管注入气管内,注意针头不要插太深,避防推延肺,反复抽吸二回,将液体抽出,大致能吸出0.7ml左右,放入灭菌离心管内。再抽取一ml生理盐水,重复上边的操作一回,那三回每便能挤出肺泡灌洗液0.玖ml左右,也注入离心管,假诺回收时遭遇相当大的障碍即可拔出注射器,收集灌洗液,在灌洗的时候能够轻轻的水疗一下,尤其是回抽的时候能够这么做,可以增强回收的频率;

微生物,八)收集的灌洗液采取0.22um滤膜过滤后,将滤膜冻存-80℃,或直接领取DNA。

 

上呼吸系统样本制备

上感有百分之七十~五分之四是由病毒引起的,包涵鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流行性高烧和副流感病毒、呼吸系统合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有五分之一~百分之三10由细菌滋生,细菌感染可径直感染或继发于病毒感染之后,以溶血性链螺杆菌最为常见,其次为流行性头疼嗜血螺杆菌、肺癌螺旋菌、肺水肿克莱伯菌等。

 

抽样材质

无菌棉拭子、含采集样品液的无菌外旋塑料管。

 

鼻腔取样

尽恐怕使明白的光辉照进鼻腔,将清新的鼻咽拭子轻轻插入鼻道内鼻腭处,停留片刻后缓缓旋转退出。以另壹拭子拭另侧鼻孔。将拭子头浸入采集样品液中,尾巴部分弃去,拧紧盖子。

 

咽喉取样 

清楚的光辉从检查者肩膀上方照射进张开的嘴巴,让病者呼吸,然后发“啊”音,用压舌板轻轻压舌,再用干净的咽拭子来回擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁,然后将拭子头浸入采样液中,后面部分弃去,拧紧盖子。

 

注意事项:

壹)咽喉取样时,拭子不能够接触到口腔和舌粘膜。

二)取样时间最棒在发病72钟头内,晨起后。

叁)鼻腔和咽部样品,可只收集1种,也可同时收集二种并混合。

 

肌肤样本制备

干净的皮肤拭子(无菌棉签)来回擦拭皮肤表面,将拭子或棉签放入无菌管内,-80℃保存,干冰运输即可。提出多擦拭多少个拭子,保障取样量。

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