菜单

海洋生物组织形元素析软件meerkatwww.bway883.com

2019年3月28日 - www.bway883.com

一、 运行meerkat

    前边已经依序安装了meerkat
的条件和meerkat,运转了预处理一步,在相呼应的bam文件目录下生成了大宗文本,因而,当要用meerkat处理有些bam文件时,应先将该bam文件移动到专有的贰个文书夹,manual中也提议如此用。

     预处理生成的文件包罗:

     黑名单文件.gz

     isinfo文件:包括插入大小音讯

     pdf文件:插入大小的遍布图,unmapped reads长度的遍布图,softclip
reads长度分布图

    
pre.log文件:日志文件,包罗输入的参数,输入输出消息,reads数,unallign
reads数等

     softclips.fq.gz: softlip reads文件,完整的read

     softclips.rdist:softclip 的reads长度分布新闻记录

     unmapped.fq.gz:unmapped的reads 文件,完整的read

     unmapped.rdist: unmapped的reads长度的分布音信

     sr1.fq.gz : 从softclip read 也许 unmaped read 切下来的内定bp
的reads

     sr2.fq.gz :  与sr1.fq配对的reads

     贰个文件夹包蕴1_1fq.gz,1_2fq.gz , 
里面有例外交司长短的reads。各样read group 人工的reads 对

   

    

   1.1  meerkat.pl

          perl ./scripts/meerkat.pl [options]

         -b  FIle    已经sort过的bam文件

         -k  int    [0/1]是或不是采用预处理发生的黑名单文件,暗许1

         -d  FLT    call discordant mate pairs
的正式差阈值,私下认可3.这么些选项控制什么寻找discordant
read对,等同于定义最大的concordant
fragment(配对的reads定位到的一对),总括办法是:中位插入大小+d x
sd,如果插入大小分布图狭窄并对称,就选用私下认可参数,例如下边一二图。要是分布图偏宽,或许带着长尾,三四图,参数应设为5,对于高深度(>30x),尽管分布图狭窄,但是使用5会轻微好一些。假诺峰窄,不过依然带着一个尾巴(图五),好像当先5/10TCGA数据那样,在meekat.pl这一步使用5比3更好

www.bway883.com 1

 

 

 www.bway883.com 2

 www.bway883.com 3

 

 

         -c  FLT    集簇discordant mate
pair标准差阈值,暗许和-d相同。控制什么集簇,塑造断点的置信区间。等同于定义覆盖断点的最大学一年级部分(中位插入大小+c
x sd)。要是-d 选项是5要么小于5,使用用-c相同的参数,假如-d
相当的大,比如10,那么使用更小的-c,比如5。如若数据有很高的测序深度,大概有常见的正片的变化,那么使用5而不是3来防止不能够创设断点的置信区间。

         -p  FLT    call二个风云匡助的配对数阈值,私下认可2

         -o  INT   
须要帮忙全长reads对的数码,私下认可是0,设定那些选项会稳中有降小复杂事件的敏感度。假若利用-a
1 -l 1推荐介绍使用-o 1 来制止重新系列导致的许多少人工业生产物

         -q  INT    call三个事件协理的split reads数,默许是1

         -z  INT    事件数的最大值,暗许1,000,000,000

         -s  INT    从unmapped reads
起首和后面切下来的bp数,必须和与处理的-s 参数设置一样

         -m  INT    [0/1],假诺设定为1,使用meerkat
去去除duplicates,即便设为0,使用Picard 的 flag ‘d‘ marked
,大概别的工具去除duplicates.bwa mem 的数量必须用picard mark duplicate
,所以要设为0.

          -a  INT   
[0/1],处理非单一比对,暗中认可1。假使测序品质倒霉,恐怕测序深度不够,将参数设为0,那样全方位成对的reads都被视作单一比对使用。这注重bwa
mapping 时生成的XT标签。假如没有XT标签,使用选拔Q.

          -u  INT   
[0/1],使用bam文件的全套比对,如若BAM文件不是由BWA发生的,大概由bwa爆发然则没有XT标签,那么开那个选项,开了那么些选项会强制关闭-a选项。暗中认可是0。开了那么些选项之后应运用-Q
参数过滤低mapping
reads,推荐-Q设置10,对于bwa比对过的bam,也足以持续过滤。

          -Q  INT    被选拔的reads的小小mapping quality,私下认可是0

          -g  INT    
在第③的bam文件使用的备择mapping数,暗中同意使用一切。备择mapping
数从前经过bwa -N 参数输出到XA标签中。bwa mem 默许 输出备择mapping。

          -f  INT    在clipped
比对初级中学毕业生升学考试虑的备择mapping数,暗许使用全部。

          -l  INT    [0/1],是还是不是考虑clipped
比对,暗中认可1.和预处理一样,对于bwa mem 出来的基因组,不须求再行mapping.

          -t  INT    在bwa比对中用到的核数,私下认可1

          -R  STR    包涵黑名单read group的公文,每一行一个read
group ID

          -F  STR    fasta文件夹路径

          -S  STR    samtools路径,尽管samtools不在环境变量中的话

          -W  STR    bwa路径,假若bwa不在环境变量中的话

          -B   STR    blastall 和 formatdb
的门道,假诺不在环境变量的话

          -P  STR   
钦赐运转顺序,dc|cl|mpd|alg|srd|rf|all,暗中认可all,每一步运维都需求上一步的结果

                            dc:  extract discordant read
pairs,提取discordant read对

                            cl:  construct clusters of discordant read
pairs,将discordant read对建簇

                            mpd: call events based on read
pairs,基于read 对call 事件

                            alg: align split reads to candidate break
point regions,比对split read
到候选的断点区域。假使你有多中央的话,能够将alg步骤切为两步,alg1和alg2,alg1周转二十四线程,alg2运维单线程。

                            srd:  confirm events based on split reads
and filter results,基于split reads和过滤的结果对事件进展表达

                            rf: refine break points by local
alignments,通过区域比对定义断点

                            all: run all above steps ,运行总体步骤

           -h    帮助

    manual 中的举例:

    50bp reads,<10x 的TCGA 基因组    使用-s 18 -d 5 -a 0 -l 0 -q
1,估算:reads 长度较小,所以取三分之一 read 长度,-s 取18, TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d 设为5, 测序深度较低,reads
长度较短,所以尽量保存数据,-a 设为0, -l 设为0,-q 设的较低,1。

    75-101bp reads, 30-40x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 3 -o 1
-a 0 -u 1 -Q 10,估量:reads长度较长,取伍分之一read长短,-s 取20,TCGA
基因组,插入分布狭窄带尾,所以-d
设为5,长度较长,深度较深,由此降低敏感度,扩张特异度,所以-p 设为3,-o
设为1,由于并未XT tag和XA tag ,由此-a 1 选项不能够运维,因而设为-u 1 -a 0
-Q 10 。借使那是bwa mem的多少来说,参数应设为-s 20 -d 5 -p 3 -o 1 -m 0
-l 0,bwa mem 数据不供给再度比对softclips -l
0,必须用picard去除duplicate,-m设为0,臆度那几个是早版本的bwa,由此比对时方可生成XT标签,-a
默许为1。

    101bp reads, 60-80x TCGA 基因组    使用-s 20 -d 5 -p 5 -o
3,75-101bp 使用-s 20,TCGA基因组使用-d 5,测序深度深,-o 设置更高3。

   
假设肿瘤基因组60x,相对应的例行基因组30x,那么使用60x的参数,平常用配对的平常协会中的black.list.gz
重命名并放到肿瘤bam文件处理的文书夹,替换cancer的blacklist.gz文件。

       

     1.2 mechanism.pl

       perl
./scripts/mechanism.pl [options]

        -b  FILE    sort过的bam文件

        -o  INT    [0/1]在TE包括rmsk类型 \”Other\”,默认1

        -t  INT    TE的最大值,暗许一千00

        -z  INT    被拍卖的SV的数量限制,暗中同意一千000000

        -R  STR    repeat注释路径,能够从UCSC下载

        -h  help

 

二、参照

   
manual中提交的数量,HapMap个体NA18507(42x深度,100bp读长,500bp插入大小),用10核bwa比对开支1.5天和10GB的内部存款和储蓄器。30x深度的瘤子数据,要多于二日并且超越30G的内部存款和储蓄器,要是测序品质不太好,比如很多的嵌合比对和众多非单一mapped的reads,就会开支更多的小运和内部存款和储蓄器。、

 

三、结果

   
运维完预处理和meerkat.pl后,能够收获七个文件.intra.refined.typ.sorted和inter.refined.typ.sorted,运营完mechanism.pl后,会博得.variants文件,不然,就该回去看一下装置是还是不是出现难点。

    
运营的瘤子基因组文件的时候,一定要把好端端组织的blacklist文件替换肿瘤基因组的blacklist文件,blacklist文件能够在预处理中生成。假使在预处理中出现错误音讯“differing
read lengths“,没有涉及,仅仅是报告您在有个别read group中长度分歧等。

 

 四 、包罗的别的程序

    4.1
转换variant 文件到vcf格式**
   **

perl ./scripts/meerkat2vcf.pl -i variantfile -o vcffile -H headerfile -F /db/hg18/hg18_fasta/

    -F选项可以发生一个头文件

    4.2  融合基因注释

 

perl ./scripts/fusions.pl -i variantfile -G /db/hg18/refGene_hg18_sorted.txt

 

    4.3  为形成位点设计引物

        使用primer.pl

        -i  FILE    输入文件,fusion.pl爆发的同归于尽文件

        -o  FILE    输出文件

        -p  ST帕杰罗    引物固定连串

         -c  INT   
列数补偿,暗许0,若是第叁列存在怎么着事件的样品名称,那么设为1

         -f  INT    侧翼区域,暗中认可500,设计引物所在的区域

         -s  STPAJERO    被“,”分隔的引物大小,私下认可20,23,25,27

         -m  ST本田UR-V    引物最小,最优,最大Tm值,”,”分隔,私下认可50,60,65

         -n  INT    对每3个引物片段,设计的音物个数,私下认可5

          -r  INT    掩盖repeat,默认0

          -q  INT    输出设计引物的侧翼类别

          -F  STPAJERO    fasta文件文件夹路径

          -P  STR    primer_core程序文件夹路径

          -L  STR    bla文件夹t路径

          -V  ST酷威    blat服务器,例如fServer start 10.11.240.76
17777/reference/hg18/hg18.2bit -stepSize=5,服务器路径应该为10.11.240.76

          -T  ST智跑    blat端口,上边例子中的17777

          -h  help

   
全体音物都以由Primer3生成,对于每1个轩然大波,挑出.1和.2,分裂的自由化认为是不相同的事件,所以取引物的时候平素拷贝出来,不供给格外的反向互补,借使系列是小写字母,那么声明引物在重新体系。理论上,你应该用
1 blat hit 挑出小写的引物。要是blat hit
是0,意味着由太多hit了,所以不要选用那种引物。有时候,就算引物是在重新体系上(小写字母),然而在基因组上依旧是纯粹比对的,(1
blat
hit),因为是重新元件的形成,挑选那种引物是能够的。要是由一些引物PCEscort没有结果,你能够选用三个正向引物,多个反向引物来还要展开伍个PC中华V 反应。引物设计的周边规则仍旧要选择,比如,你应该选取TM
值相差十分的小并且GC含量不太极端的。

    4.4  总括等位基因频率

        使用discon.pl,这几个脚本会告诉你全部断点的discordant 和
concordant的read对.

        -i  FILE    输入variants 文件,必须

       -o  FILE    输入文件,必须

       -D  INT    从bam文件中总结discordant
pair的多少,暗中同意0,基因分型的时候打开那么些选项

       -B  FILE    bam文件,必须

       -C  FILE    由Meerkat 产生的cluster文件,必须

       -I  FILE    Meerkat 运转时发生的isinfo文件

       -K  FILE    包罗要不经意的read group的文书名,二个read ID 一行,和
meerkat.pl的福睿斯参数一样

       -S  FILE    samtools文件夹路径,若是samtools不再环境变量中

       -d  FLT    call discordant read 对的正经差阈值,暗中同意3

       -Q  INT    使用的reads 最小的mapping quality,默认0

       -h  help

      

perl ./scripts/discon.pl -d 5 -Q 10 -i $somaticg -o $somaticg_rp -B $cancer_bam -C
$cancer_cluster -I $cancer_isinfo -K $cancer_blacklistrg -S /home/ly55/opt/samtools/

    结果文件之中每三个风云有多少个 QX56P tag ,A_B_www.bway883.com,C_D格式

    A:全长的discordant read 对数

    B:从部分比对的reads中discordant的reads数

    C:第1断点的concordant reads 数

    D:第①断点的concordant reads数

    A+B应该等与Meerkat获得的总的reads数

       

 

 以上内容仅作个人笔记使用,仅供参考

 

参考资料

meerkat manual
:http://gensoft.pasteur.fr/docs/Meerkat/0.189/Manual\_0.189.pdf**
**

相关文章

发表评论

电子邮件地址不会被公开。 必填项已用*标注

网站地图xml地图